1953年4月25日，沃森和克里克在英国著名的《自然》杂质上发表了划时代的论文，建立了DNA双螺旋结构模型，开辟了分子生物学的广阔道路。在分子生物学的理论基础上，基因工程蓬勃地开展起来。

    限制性内切酶是一种对DNA分子内部特定部位进行识别和切割的生物催化剂，生物学家称它是一把对DNA进行特殊“手术”的“分子剪刀”。大家知道，DNA是由四种核苷酸排列成的大分子，是具有特定顺序的生物信息载体；遗传的信息单位——基因，就蕴含在这种特定的顺序之中。DNA分子很大，比如，嗜血流杆菌这种微生物长度只有1微米，而它的DNA竟长达832微米，超过细菌自身800多倍。一般来说，在细菌的DNA中大约还有几千个基因，而在人类这种高等生物的DNA中，所含的基因约3万个。人们如何来认识这么长的DNA分子的顺序？如何来认识如此众多的基因结构和功能呢？这个问题在过去真让分子生物学家“望洋兴叹”。难怪有人把DNA分子喻为一部长达数十万乃至数百万页的“天书”。它包含了细胞生长和发育的所有信息，但不幸每一页都粘合在一起，难以解读。就是这种状况下，DNA限制性内切酶被发现了，有了这把“分子剪刀”，科学家们便可以对DNA这个巨大分子进行各种各样特定的切割“手术”；有了这把“分子剪刀”，科学家们便可以很方便地翻阅开DNA这部“天书”，直到醉醉读懂它的每一页。而这样也就可以搞清楚整个DNA分子的顺序，搞清所有基因的结构和功能。更令人兴奋的是，人类还可以按照自己的意愿，直接对DNA这种遗传物质进行改造，即所谓重组DNA技术，创造出崭新的，自然界未曾有过的新物种，这就是发展神速、前途远大的“基因工程”。

    在实施基因工程时，首先的工作就是要得到我们感兴趣的基因，即目的基因。随后还要把目的连接在载体上，即基因重组。目的基因是存在与DNA大分子上有一定长度的片段，必须从DNA大分子上把它准确无误地切割下来，同时，要时目的基因嵌入各种载体中去，也必须将载体打开缺口，这些工作都需要切割工具——限制性内切酶。这把“分子剪刀”能极精确地识别DNA分子中特定的碱基序列，是分析基因组、分离基因、制作基因图谱以及体外重组具有生物活性的杂种DNA分子等工作中极为有用的工具酶。

    限制性内切酶是自然界中本来就存在的东西，他剪裁DNA之准确、精密及灵活性，不是任何人类发明的机器和化学反应所能比拟的。然而，当限制性内切酶被发现时，只有少数科学家洞察到他的从要意义，大多数科学家都认为，这列酶研究艰深难懂，而且好像没有实用价值；当将它们和许多别的发现相比较时，似乎限制性内切酶只能算是纯科学的东西，看不出具有什么很大的应用价值。然而，仍然有许多有远见的科学家投入到限制性内切酶的研究领域。

    20世纪60年代，当瑞士科学家阿尔伯（W.Arber）在分析10多年前由美国微生物遗传学家贝塔尼（G.Bertani）和魏格勒（J.Weigle）发现的、被称为“宿主控制的限制与修饰作用”的一种难以理解的细菌现象时，发现了这些内切酶。阿尔伯在一系列简单而精致的实验中证明细菌的这种现象是由DNA的变化所引起的，外来的DNA被降解了，显然这是用来保护宿主免受外来基因侵袭的。于是1965年阿尔伯提出细菌含有限制性内切酶的假设，认为这种酶具有识别DNA中重复出现的结构单位并能与之结合的能力。DNA在这些位置上被切断，犹如一本百科全书一页页地被分开来而又不毁坏原文。

    阿尔伯只是推测有限制性内切酶的存在，而美国分子生物学家史密斯（H.O.Smith）则证实了阿尔伯的假设。1970年，他提纯了一种限制性内切酶，并证明它们能切开外来的DNA。他测定了这种酶所切开的DNA区段的化学结构，并发现了后来也适用于其他限制性内切酶的某些规则。今天已知道，可能有100多种这样的酶，它们读在彼此不同的确定的区段上切割DNA。我们可以借助于限制性内切酶把巨大的DNA分子分成界限分明的片段，随后用这些片段做结构分析和遗传实验。

    限制性内切酶研究发展的最后一步是由美国分子生物学家纳森斯（D.Nathans）迈出的。1971年，他最先把斯密斯分离提纯的限制性内切酶用于遗传学，他的工作激励了这一领域的科学家。他用限制性内切酶一种猴病毒的DNA，并制作了生物学史上第一张基因图谱。后来别人利用他的方法，制作了更多更复杂的基因图谱。今天我们已经能够写出纳森斯最初研究的猴病毒40（SV40）基因的整个化学结构。

    由于阿尔伯、史密斯和纳森斯前仆后继，在发现和应用限制性内切酶方面做出了关键性贡献。


    20世纪50年代初美国生物学家卢里亚等许多科学家都注意到，同一种细菌的某些品系不会被噬菌体感染，其他品系则会被感染，也就是说，假如噬菌体被注入会被感染的品系细菌体内，就会大量复制繁殖，产生数百万个噬菌体子代，但假使相同的噬菌体被注入其他不同品系细菌中，就一点也不复制繁殖。上述实验中细菌两个品系里的噬菌体是相同的，这事实引发了限制性内切酶的思想的形成：根据噬菌体在细胞不同品系间表现所存在的差异，把可以防止噬菌体在其内繁殖的细菌品系，称作“具有限制力”，即具有防止噬菌体感染的能力。

    可在某一特定细菌品系（非限制型）内生长得很好的噬菌体，在另一品系（限制型，具限制力）中，即使能存活下来也不会生长得好，而且只有少数几个噬菌体会存活下来。但若将这些存活下来的噬菌体接种到另一个限制型细菌品系中，它们却变得可以快速繁殖，也就是说，它们不会受到这个细菌品系的限制了。如果将这些从限制型细菌品系中存活下来的噬菌体，再接种回它们原来生长繁殖很快的细菌品系中后，反而生长得很差了。换言之，噬菌体如果在限制型细菌品系中经过一次感染周期，就能使它们在限制型细菌品系中生成得很好。针对这现象可能的解释之一，就是细菌可能对噬菌体做了某种程度的修饰，这些修饰让噬菌体可以在限制型细菌品系中生长。

    对不同的细菌品系“限制与修饰系统”的研究显示，这是个共同的现象，也就是说许多细菌都有这种功能，但每种细菌的修饰都是该细菌品系特有的，即当噬菌体被某一种细菌品系修饰 后，便能在这特定的品系中生长得很好，但却不能在其他品系中生长良好。目前已清楚知道，细菌存在一种以上限制与修饰系统，所以细菌对噬菌体的修饰方式也不是只有一种。

    如果细菌真的具有这种本领，那么它是通过什么途径获得这种本领的呢？这个问题在十多年以后终于被瑞士科学家阿尔伯找到了答案。

    阿尔伯1926年6月3日生于瑞士，1953年毕业于苏黎士工学院。而后进入日内瓦大学生物物理实验室任电子显微镜研究助理。1958年，阿尔伯获博士学位后，来到美国南加利福尼亚大学，在贝尔塔尼的指导下进行分子遗传学的研究。于1960年应著名科学家凯伦伯格（E.Kellenberger）之邀回日内瓦领导一个研究组，专攻辐射对微生物的效应课题。

    50年代末，辐射生物学是一个热门话题。阿尔伯就是研究辐射对遗传物质的损伤作用，以及后者的修复机制对遗传重组的影响。并且他此前的研究课题也与辐射有关，也许这正是一个物理学家步入生物学领域的最佳入口。

    阿尔伯着手进行噬菌体的遗传学实验。一次他得到了一种菌株，它不允许γ噬菌体实现有效感染。阿尔伯在感到以外的同时，马上想起了前人已多次描述过的细菌受宿主控制的修饰现象。

    他马上召集研究助手，重复前人的实验，开展了一系列的研究工作。他深入探索了噬菌体与细菌的关系后提出：在细菌与噬菌体之间，有一种对各自DNA予以修饰和限制的作用，而这种作用涉及细菌中的两种酶，一种是限制性内切酶，另一种是甲基化修饰酶，限制性内切酶对DNA有切割降解作用，这样，细菌通过对外来噬菌体DNA的破坏作用，使之不能存活。而甲基化修饰酶，对细菌本身的DNA的特定部位予以修饰，使之不为自己的限制性内切酶所切割降解。但同样地，同一细菌品系的噬菌体的DNA，也能被这种甲基化酶所修饰，从而得到保护，能正常感染繁殖。这样，阿尔伯就合理地解释了噬菌体寄主控制修饰现象，同时首次从理论上提出了限制性内切酶存在的假说。

    阿尔伯与1978年获得诺贝尔生理学医学奖后，他的大女儿刚好10岁，真想知道父亲究竟发现了什么了不起的发现。当阿尔伯的女儿了解了限制性内切酶的基本原理后，用童话班的语言，描述了这一机理：

    国王和仆人的传说
    “当我来到父亲的实验室时，我经常看见桌子上放着一些盘子，这些盘子里含有细菌克隆。这些克隆令我想到一座有着许多居民的城市。在每一个细菌群落中都有一个国王，其形状是细长细长的。国王有许多仆人，看上去有些圆鼓鼓的，就像球一样。父亲把国王叫做DNA，仆人叫做酶。这位国王像一本书，每一件需要仆人去做的事都被记载在这里。对于我们人类来说，这些国王的行为实在是一个迷。

    “国王已经发现了一个仆人，他的作用好比一把剪刀。如果一噶外来的国王入侵了一个细菌群落，这个仆人就会把它剪成许多小的片段，但是，他绝不会对自己的国王轻举妄动。

    更为聪明的人类，派遣这位像剪刀的仆人去寻求国王的奥秘。当各位像不同型号剪刀的仆人接近国王时，国王就被剪成了片段。当然，比较小的片段更容易揭示国王的秘密。因为这个理由，我的父亲获得了诺贝尔奖，是他发现了像剪刀的仆人。”

    20世界60年代初，阿尔伯从理论上假设了限制性内切酶的存在，并在1968年与美国生物学家科恩（S.N.Cohn）分离出了一种I性限制性内切酶。可是这种I型酶不能用来对DNA的遗传结构进行更深入的研究，更不能进行人工改造。所以，这种I型酶的发现，并没有引起分子遗传学家的多大兴趣。是否存在新的，行之有效的限制性内切酶呢？

    虽然阿尔伯未能纯化这种内切酶，但他为以后的研究指明了方向。与阿尔伯几乎同时，分子生物学家梅赛尔森（M.S.Meselson）从大肠杆菌K品系制备出了高纯度内切酶，并用蔗糖密度梯度离心证明，这种酶可将未修饰的摄入DNA切割成较大的片段，而被修饰过的DNA则完好物损。但令他们失望的是，这种酶的识别部位是特异的，而切割部位是随机的，即识别和切割不一致。梅赛尔森等人的文章，引起了刚刚到约翰斯.霍普金斯大学大学微生物学系工作的史密斯极大的兴趣，并感受到他传递着阿尔伯所预言的限制性内切酶的现实性。

    史密斯1931年8月23日出生一美国纽约。早年曾在伊利诺伊大学主修数学，由于对生物学强烈的兴趣，不久转入加利福尼亚大学，专攻生物学。1952年毕业后进入约翰斯.霍普金斯大学医学院学医，1956年获该校医学博士学位。毕业后在密苏里州圣路易斯的一家医院当医生。957年起应召在海军服役两年。服役期间，他继续关心生物学进展，特别倾心于群体遗传学的进展。1959年服役期满，史密斯继续任医生，但是他仍不断关心和研究分子生物学。1962年，他获得专门从事科学研究的机会，受聘前往密歇根大学人类遗传学系执教。1967年史密斯回到了约翰斯.霍普金斯大学，出任微生物副教授。此时史密斯和他的学生威尔克斯（K.Wicox）开始探索嗜血流感菌的遗传重组问题。一部分实验是从已摄入外源DNA的细胞中回收供体DNA。在一次实验中，它们对噬菌体P22的DNA标记后，感染细菌，经过令他们吃惊：他们从细菌中回收不到噬菌体P22的DNA。由于梅赛尔森的文章仍盘旋在斯密斯的脑海中，他马上意识到，噬菌体P22的DNA可能被宿主限制（裂解）了，而实验中所用的粘度计正是分析这种现象的有力手段。第二天，他们使用两台粘度计进行实验，一台加入噬菌体P22的DNA，另一台加入嗜血流感菌的细胞提取物。随着实验的进行，他们变得异常激动，因为嗜血流感菌的DNA黏度没有改变，而噬菌体P22的DNA的黏度却下降了。这个实验显示，细胞提取物中含有一种新的、活性很好高的内切酶，这种酶反应过程仅需要镁离子作为辅助因子，它与先前别人所报道的从大肠杆菌K和B品系中提取的内切酶不同。从此，斯密斯实验室停止了其他一切工作，包括他的细菌重组实验，集中全力进行该项研究。

    经过多次失败，史密斯实验室终于纯化了这种内切酶。蔗糖密度梯度离心实验表明，经该酶降解的噬菌体P22的DNA片段长约1000个碱基对，这种酶的其他反应特点是，仅切割双连DNA，对单链DNA不起作用；反应产物中无游离的单核苷酸，在DNA产物上不留缺口。从以上反应特性来看，这种酶的切割部件似乎具有序列特异性。但呀证明这一点必须多切割后的DNA片段末端进行序列分析。

    史密斯师徒二人对DNA片段末端测序工作始于1968年底，他们采用哈佛大学韦斯（B.Weiss）和查理森（C.C.Richardson）设计的方法进行顺序分析。这种方法首先用T4多聚核苷酸酶及γ-32P标记的腺苷三磷酸（ATP）将DNA 5′末端进行放射性磷标记，然后用胰脱氧核糖核酸酶及蛇毒磷酸二酯酶酶解，以得到末端核苷酸，或用核酸外切酶I产生末端二核苷酸。这些产物可经电泳分离并通过与已知样品核苷酸比较加以辨别。

    1967年秋，韦斯来到霍普金斯大学并在微生物系邻近的一个实验室工作。他对斯密斯的实验步骤给予了许多指教并供给他们激酶及γ-32P标记的ATP。他们用限制酶降解T7噬菌体DNA开始做顺序分析，后来他们才知道这是一个很幸运的选择。在第一次实验中，他们发现为获得标记必须首先用碱性磷酸酶去除切割片段5′端磷酸基团，这样对DNA链的切割就会产生3份-羟基，5′-磷酸末端。接着，他们检测了末端核苷酸，发现末端32P标记仅出现于脱氧鸟苷酸（dGMP）和脱氧腺苷酸（dAMP），由此，他们发现他们的酶是专一性的！

    1969年初，史密斯准备在双核苷酸水平上开始工作，不巧的是，就在这个及其激动任性的工作阶段，威尔科克斯收到了征兵通知书，因此史密斯只等让他退出了这项工作。这下子可忙坏了史密斯，他既要准备双核苷酸标记物，又要制备核酸外切酶I。花费了好几个月的时间，他终于进一步证明了末端的双核苷酸不是（5′）pGpA，就是（5′）pApA，酶切割部位的特异性更明显了。

    史密斯认为，若想搞清DNA片段末端三个或更多的核苷酸组成，韦斯方法已经显得无能为力了，因为标准的寡核苷酸是难以得到的。看来必须考虑新的方法。经过与新进入实验室的凯利（T.J.Kelly）进行多次讨论，他们设计出后来被证明成功的双重同位素标记法，应用这种方法最终彻底证明了切割的特异序列是（5′）pPu-A-C（Pu代表嘌呤核苷酸），由于3′末端与5′末端是互补的，因为推测出该酶所识别和切割的部位是双侧对称的六个核苷酸。

    …（5′）G-T-Pu-A-C（3′）…
    …（3′）C-A-Pu-T-G（5′）…

    这种酶后来被称为为Hind Ⅱ，它是第一个发现并得到鉴定的限制性内切酶，迄今已有多种内切酶被相继分离，至少可以识别85种不同的核苷酸序列

    史密斯幸运在于他在实验中使用了嗜血流感杆菌，而不是阿尔伯、梅赛尔森所使用的大肠杆菌B品系和K品系。后来发现从B、K品系提取的内切酶是一类复杂的多聚体，需要有ATP、镁离子等多种辅助因子参与才能行使功能，并且其切割部位也没有特异性。这类酶被称为I类，他们的上述特性限制了它们在DNA分析中的应用。史密斯使用嗜血流感杆菌的目的，起初不是为了限制性内切酶的研究，而是为了研究遗传重组。可以说嗜血流感杆菌不是他有意识的选择，而是一种巧合。同时史密斯在分析那种内切酶的时候，使用了T7噬菌体DNA作为切割对象。后来的工作发现，史密斯所纯化的内切酶，实质上是两种酶的混合物，除了Hind Ⅱ外，还有一种能识别切割另一种核苷酸序列的Hind Ⅲ，幸运的是Hind Ⅲ恰求对T7噬菌体DNA不表现活性。设想若是以另一种噬菌体作为切割对象，两种内切酶都表现出切割活性，同时分析由两种内切酶造成的序列各异的DNA片段末端，史密斯不会得出酶切序列是特异性的结论，他必然碰壁，因为他对所提纯的内切酶中还隐藏着Hind Ⅲ这一点在当时是没有丝毫察觉的。

    史密斯为自己的发现而十分兴奋。他马上写信告诉他的同事——远在以色列进行访问工作的内森斯。内森斯也为之庆幸，并热烈地响应，随即回到约翰斯.霍普金斯大学，用这种Hind Ⅱ酶去分析SV40的DNA结构。遗传工程的新篇章由此揭开了。

    纳森斯1928年10月30日生于美国特拉华州的威尔明顿。1950年毕业于特拉华州立大学化学系。后入华盛顿大学深造，1954年获得医学博士学位后，前往纽约一家医院当医生。1955年进入国立卫生研究院（NIH）任临床助理，获得了参加浆细胞肿瘤细胞生成骨髓瘤蛋白质的研究机会。

    1957年，纳森斯又回到纽约做了两年医生，此后进入洛克菲勒研究所李普曼实验室任客座研究员。他和同事们一起发现了细菌的“延长因子”，还发现了一种噬菌体RNA可以指导病毒衣壳蛋白的合成。在这些实验中，他的生物化学研究能力获得了提高，决心长期从事分子生物学的研究。1962年他应邀来到巴尔的摩的约翰斯.霍普金斯大学医学院工作，继续研究噬菌体遗传问题。

    20世界60年代中期，纳森斯兴致勃勃地从事一种大肠杆菌的核糖核酸噬菌体的微生物遗传研究，然而他对动物肿瘤病毒却知之甚少。有一次，学校的医生请他做有关肿瘤病毒的专题演讲为了硬付这份差事，他不得不查阅大量肿瘤病毒的文献资料。在查阅过程中SV40引起了他的注意。纳森斯后来回忆道：“这样一种简单的病毒，在动物体内以及对组织培养的细胞生长具有如此深刻的长期效应，给予我及其深刻的印象。”此后，他便把研究重点有大肠杆菌的核糖核酸噬菌体转向了SV40。

    1969年初，纳森斯前往以色列的威茨曼科学研究所考察动物细胞和病毒的研究情况。就在这时，他收到了史密斯的来信。这封信导致了一个重要的突破。

    纳森斯获悉史密斯成功的消息后，十分兴奋。他手头已有了SV40这个很理想的生物材料，而史密斯的限制性内切酶，正好提供了解剖SV40DNA最好的“分子剪刀”，纳森斯随即用史密斯的Hind Ⅱ酶来分析SV40基因组织结构。他后来回忆说：“我认为，如果一个肿瘤病毒的DNA能够被这样的没所切割，如果每一被切下来的片段都能分离，那么就有可能确定每个DNA片段的功能”纳森斯在1969年夏季从以色列返回美国，马上开始对SV40 DNA的研究工作。他和阿德勒（S.Adler）一起用史密斯的Hind Ⅱ酶成功的切割了SV40 DNA后，又指导他的学生达纳（K.J.Danna）和萨克（G.H.Sack）继续深入研究。1971年，他们把所切割的SV40的DNA片段，用电泳方法区位为11个片段，并确定了这些片段在SV40基因组中的排列次序，还分析了它们的复制起点和终点以及复制方向，从而建立了第一个DNA图谱。

    一年以后，纳森斯和他的同事又分离出不同感染时期的SV40的信使核糖核酸（mPNA)，并利用这种mRNA与SV40的DNA的不同片段进行所谓分子杂交，这样又建立了第一个核糖核酸的转录图谱。因此，纳森斯成为第一个影一样限制性内切酶从事基因结构研究和功能研究的先驱者。受纳森斯等人工作的鼓舞，此后许多分子生物学家用限定性内切酶对许多基因结构和功能进行了大量的研究。

    限制性内切酶的发现除了理论上的突破意义外，在实践上通过它的应用而揭开了遗传工程这个新篇章。史密斯在回顾这段研究历史时曾经说过一段意味深长的话：“寄主控制的限制和修饰看来似乎是并不显眼的细菌学中的现象，可是他导致了一类酶的发现。而这样一件事又出乎意料地大大推动了科学的发展。”

    限制性内切酶在DNA链上有一个特定的识别位点。测点该位点上核苷酸的顺序，原来十分复杂，是一件气味繁重的工作。如今科学家已设计出了相应的计算机软件，生物学家只要通过计算机对现在性内切酶做出相应的处理，就可以计算出它识别和切割的特异核苷酸序列了。

    目前已发现的限制性内切酶将近500种，其中50余种已获得广泛应用。限制性内切酶可以分成三型：Ⅰ型酶由不同的亚基组成，具有ATP依赖性的水解活性和甲基化活性；Ⅱ型酶由相同的亚基构成，仅具限制酶活性，它们能识别的DNA专一性序列通常为4——6个碱基对，并在特定位点将底物水解，因而在分子遗传学中应用广泛；Ⅲ型酶仅有数种，如Hind Ⅲ，但其切点未定。

    近年来，限制性内切酶在细胞遗传学中的应用也相当普遍，如一些科学家使用限制性内切酶处理用甲醇-冰醋酸固定后的哺乳动物中期染色体，观察到特征的带纹，而且不同的限制性内切酶处理可产生不同的带型这些研究虽然还是初步的，但其结果不仅丰富了染色体显带技术的内容，也为研究染色体结构及化学本质提供了新的手段。与此同时，另一些科学家进而对限制性内切酶的显带机理进行了探讨，认为限制性内切酶的显带作用与染色体上DNA片段选择型抽提有关。还有一些科学家为了考察和研究染色体畸变的发生和机理，用限制性内切酶诱发染色体畸变。限制性内切酶在细胞遗传学领域中的应用研究，渴望沟通分子遗传学与细胞遗传学之间的鸿沟，有助于对染色体精细结构、显带机理等一系列理论问题阐明，并有助于对更多遗传异态现象的研究，疾病诊断和肿瘤病因的探讨。